微生物脂肪酶的稳定性提高方法及其在食品工业中的应用

脂肪酶（EC3.1.1.3）又称三酰基甘油酰基水解酶，广泛存在于细菌、酵母、真菌、植物和动物中。由于微生物种类多、繁殖快且微生物脂肪酶一般是胞外酶，因此，微生物脂肪酶是工业脂肪酶的重要来源。

自然界中大约有2%的微生物产脂肪酶，细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶，pH在4~11、温度在30~60 ℃之间具有良好的稳定性，同时细菌脂肪酶多数是胞外酶，易于液体深层发酵。目前，细菌的一些野生菌或重组菌株得到了商业开发，其中最重要的是无色杆菌（Achromobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、节细菌属（Arthrobacter）、芽胞杆菌属（Bacillus）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、色杆菌（Chromobacterium）和假单胞菌属（Pseudomonas）等。

霉菌脂肪酶的主要包括根霉、曲霉、青霉和毛霉等菌株产的脂肪酶。根霉脂肪酶由于具有高度的sn–1，3 位置特异性和较好的立体选择性，越来越受到研究者的关注。目前已经克隆出多种根霉脂肪酶基因，并且在多个表达系统中获得表达。黑曲霉脂肪酶最适底物的脂肪酸碳链长度为C6~C12，具有较高的生物安全性，因此一直作为重要的食品添加剂。

酵母菌主要有皱褶假丝酵母（Candida rugosa）、南极假丝酵母（Candida antarctica）、柱状假丝酵母（Candida cylindracea）、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）、木糖毕赤酵母（Pichia xylosa）等。

脂肪酶的结构及催化机理

所有的微生物脂肪酶都属于α/β水解酶超家族。不同微生物的α螺旋和α螺旋的空间分布、β折叠的数量和β折叠扭曲角度存在差异，构成不同的脂肪酶空间结构。脂肪酶催化酯键断裂可分为4个阶段：底物与酶结合；瞬间形成四面体中间复合物；形成稳定的共价中间体复合物；酰基化合物的释放。

微生物脂肪酶的活性中心是由 Ser–His–Asp/Glu 组成的催化三联体结构，在其周围还存在 Gly–X–Ser–X–Gly 组成的五肽结构，α/β水解酶折叠结构为脂肪酶的活性位点提供了一个稳定的支架。大多数脂肪酶具有1个α螺旋形成的“盖子”结构，“盖子”的外表面相对亲水，而内表面则相对疏水，该结构不仅影响酶活性，而且影响酶对底物的特异性和稳定性。

当脂肪酶与油–水界面相接触时，覆盖活性位点的α螺旋打开，暴露疏水残基，增加与脂类底物的亲和力，同时该变化导致脂肪酶在Ser周围产生亲电区域，可保持催化过程中过渡中间产物稳定，使脂肪酶处于活化构象。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的脂肪酶是已知的分子量最小的脂肪酶之一，它没有α 螺旋构成的“盖子”结构，所以没有“界面激活”现象。

提高脂肪酶稳定性的方法

1、利用蛋白质工程技术提高脂肪酶的稳定性

为了满足酶需求不断增加的各类工业生产，研究者一方面从自然界筛选符合要求的酶，一方面利用蛋白质工程技术来改造天然酶，使其更好地适应工业应用环境。增强酶的稳定性是蛋白质工程技术研究的重要内容。目前利用蛋白质工程技术提高脂肪酶稳定性的策略主要有3种：定向进化、理性设计以及二者相结合的半理性设计。

定向进化（directed evolution）是指首先使用物理/化学诱变或者易错PCR（error-prone PCR）等方法对目标基因进行随机诱变构建突变体库，经过高通量筛选得到性能提高的突变体，然后再利用体外重组的方法将这些正向突变进行重组，进而筛选出目标性状大幅度提高的突变体的方法。定向进化通常用于设计提高稳定性的酶。研究表明，利用定向进化手段可以得到稳定性显著提高的突变体脂肪酶。

理性设计（rational redesign）是指在较为清楚地了解蛋白质的结构、功能和相关性质分子机制的基础上，先从理论层面上对蛋白质分子中特定氨基酸位点的改变进行设计，然后利用定点突变的方法在蛋白质中引入这些突变位点。利用理性设计得到的稳定性显著提高的突变体脂肪酶相较于野生型酶具有更广泛的工业应用价值。

大量研究数据表明控制蛋白质某种性质的位点可能仅仅局限于序列的某一小部分，例如对底物的特异选择性或酶活力取决于活性中心区域，而酶的稳定性等性质却主要和酶的外围位点或活性中心附近位点密切相关，因此需要将理性设计和定向进化结合：先利用随机突变确定决定目标性状的位点，再理性地选定一些位点进行重组或饱和突变，进一步提高酶目标性状的改造效率，该方法即为半理性设计（semi-rational design）。在蛋白质结构比较和序列比对的基础上，再借助计算机模拟，可以在很大程度上剔除有害或中性突变，从而实现在缩小突变体库的前提下获取更多有利突变。

2、利用酶的固定化技术提高脂肪酶的稳定性

酶的固定化是提高脂肪酶稳定性的常用策略之一。当脂肪酶加入到反应介质中时一般是以溶解的状态存在，这就难以实现对其进行回收，此外，在反应进程中，一些参数非预期的变化，例如温度和 pH 等的变化可能会导致酶的变性或者失活。然而，大多数酶在多轮催化反应后仍然能保持活性，具有较高的回收利用价值，回收利用酶的方法之一就是将其固定在不可溶的基质上。

此外，固定化酶往往比溶解状态的酶有更高的稳定性，可以在极端的环境下发挥功能且有着更高的转化效率。根据酶与载体之间的相互作用，酶的固定方法可以分为物理方法和化学方法。在物理方法中，酶与载体之间主要形成氢键和范德华力等较弱且可逆的相互作用；在化学方法中，酶与载体之间则是通过形成共价键联系在一起且不可逆。

物理方法固定脂肪酶包括吸附作用和酶的封装及诱捕。在吸附固定化方法中，酶分子通过范德华力、疏水相互作用、氢键和离子键吸附在载体表面，该方法常用的载体为阳离子和阴离子交换树脂、活性炭、硅胶、氧化铝、可控孔径玻璃、陶瓷、天然材料如纤维素和琼脂糖以及一些工业残留物。近年来，纳米复合材料的使用因为其结合了各种材料的优势，成为酶固定的理想材料。吸附固定过程简单、成本低，只需要两步即可完成，因此，该方法是近年来研究最多的脂肪酶固定方法之一。

在封装固定中，酶保留在有孔径且允许底物和产物通过的聚合物结构中。与吸附不同，封装可以避免酶与反应体系直接接触，从而使得由于培养基中溶剂的性质引发的失活效应最小化，此外该方法允许酶在相对长的时间内保持稳定，并且没有必要从培养基中提取酶；不过，这两种固定方法的主要问题是难以控制底物和产物在载体内扩散的孔径大小会使酶浸出，且难以实现大规模的应用。

化学方法固定脂肪酶包括共价结合和交联。在共价结合固定方法中，酶与载体之间以共价键的方式结合，酶分子的侧链氨基酸，即含有有利于形成共价键的官能团（羟胺、羧基、咪唑和酚类化合物）的氨基酸残基，例如赖氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸和谷氨酸残基等与载体材料之间发生化学反应形成共价键。因为共价键是一种强的化学键，共价固定使酶与载体紧密结合，保证了酶结构的刚性，这种刚性可以保证酶分子的结构在遇到热、有机溶剂和极端 pH 等环境时不发生变化，从而保证了其稳定性。

不过，共价结合也可能改变酶分子的活性中心，从而导致其失活。要避免这种情况的发生，就需要通过活化反应对载体表面进行修饰，提供与酶分子的官能团发生相互作用更活跃的官能团。该方法为提高脂肪酶的催化活性和稳定性开辟了一条新的途径，并可能在各种以脂肪酶基础的工业过程中具有潜在的应用前景。

交联固定的过程是由称为交联剂的物质完成的，该交联剂含有2个末端，能与溶解酶分子表面氨基酸的特殊基团形成分子内和分子间交联，最终形成交联酶。将酶加入含有交联剂的媒介中就能形成交联酶、交联酶晶体、交联酶聚合物以及交联喷雾干燥酶。由于排除了固体支持物，交联酶的主要优点是高度催化的酶活性、高稳定性和低生产成本。

脂肪酶在食品工业中的应用

1、面食加工

烘焙食品是以面粉、酵母、食盐、砂糖和水为基本原料，添加适量的油脂、乳品、鸡蛋、添加剂等，经一系列复杂工艺手段烘焙而成的方便食品。最近几十年，研究者开始利用脂肪酶代替烘焙制品中的乳化剂：双乙酰酒石酸单甘油酯（DATEM）和硬脂酰乳酸钠（SSL）。

将脂肪酶添加到面包的配方中，可以增加面团的柔韧性和产气量，进而增加面包的体积，使面包更加柔软。脂肪酶还可以与其他酶制剂复合，从而改变产品的品质。如脂肪酶与葡萄糖氧化酶复配后加入面团，能够提高面包的入炉急胀率，且对面包芯有二次增白作用。

2、生产类可可脂

由于可可豆的生产受到气候、地理等条件的限制，可可脂的产量远不能满足巧克力生产的需要，因此需要可可脂（Cocoa Butter，CB）的替代品类可可脂（Cocoa Butter Equivalent，CBE）。CBE 具有与CB 非常相似的物理、化学特性和口感，且与CB 能任意比例混溶。

CB 的脂肪酸的主要组成为棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，其中 sn–2 位主要的脂肪酸为油酸，含量约为68.7%。特殊的脂肪酸结构决定了类可可脂的生产工艺是以 sn–2 位油酸含量较多的油脂为底物，用棕榈酸和硬脂酸替代 sn–1，3 位的脂肪酸，可获得与可可脂类似的脂肪酸构型。目前，合成类可可脂的原料主要有棕榈油、茶树油、茶树籽油和乌桕脂等。

3、食品添加剂

油脂和糖酯类食物在人类食谱中占有重要位置，也是人体中一种必须营养物质。随着人们生活质量的不断提高，对于脂类食物的品质要求也逐渐提高，鉴于脂肪酶所具有的位置特异性，人们可以通过改造脂肪酸的构成位置来改善脂类食物的各种性质。

例如，可以采用改造糖酯脂肪酸碳链长的方法来调整其亲水性，经过改造的糖酯可以成为水包油型或油包水型乳化剂，可以作为食品添加剂，具有可降解、无味、无嗅等性质，现已经广泛应用于食品改良和食品保鲜等领域。

参考资料：

[1]申卫家,郦金龙,黎金鑫等.微生物脂肪酶的研究进展及其在食品工业中的应用[J].粮食与油脂,2017,30（04）:5-7.

[2]汪玲.微生物脂肪酶的性质及应用[J].生物化工,2020,6（03）:161-163.

[3]徐碧林,朱庆.微生物脂肪酶稳定性研究进展[J].微生物学通报,2020,47（06）:1958-1972.

作者简介：

小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。