益生菌蓬勃发展的背后技术力量：高密度发酵

       益生菌的高密度发酵概念

       高密度发酵是一个相对概念，主要是指通过改进指定培养装置或培养技术，使菌体密度相对于高密度发酵之前有较大提升，同时缩短培养周期、减少培养体积。而从广义上来讲，凡是菌体密度比较高，以至接近其理论值的发酵均可称为高密度发酵。

       高密度发酵的主要影响因素

       高密度发酵是近年来发展起来的一项新技术，与常规发酵相比较，可以显著提高菌体密度，缩短生长周期，并生产出高质量高产量的浓缩型发酵剂。高密度发酵过程中菌种的活力、培养代数，培养基的成分，增殖因子，培养条件等，都是影响高密度培养的重要因素。

       发酵温度：不同的乳酸菌菌种其生长最适温度存在一定的差别。温度通过影响蛋白质等大分子的性质及酶的活性，进而影响乳酸菌的繁殖和代谢。不同的发酵温度不仅影响菌株的活力及细胞的生长，对于冻干菌粉的活菌数和组织状态也有影响。

       发酵pH值：适宜的pH值是乳酸菌高密度发酵的基础条件。乳酸菌有其最适生长pH范围，培养基中的氢离子浓度若超过了乳酸菌的pH适宜范围，就会抑制其生长，不同的乳酸菌对酸性条件的酎受性有很大的差别。例如有试验发现通过对嗜热链球菌ND03发酵过程中pH的值选择后得出，培养基初始pH值为7.2，发酵pH值5.8时，ND03 发酵液的活菌数可达1.8x1010CFU/mL。

       发酵液的氧含量：发酵液中的氧含量也是影响乳酸菌高密度发酵的重要因素。厌氧微生物对环境中溶氧量非常敏感，高溶解氧浓度会导致厌氧微生物失活，如氧对双歧杆菌有致死作用。嗜酸乳杆菌是兼性厌氧菌，培养基中的溶氧量可能直接影响其生长，不同的氧化还原电位可能使嗜酸乳杆菌的代谢途径发生改变，从而影响菌体的生长。抗坏血酸和半胱氨酸盐酸盐是消耗培养基中氧及降低氧化还原电位的常用试剂。

       高密度的发酵方法

       细胞循环培养：细胞循环培养是一种利用一些高科技手段，将细胞截留在原来的培养环境中，而将产物分离出来，达到排除抑制性代谢产物的一种培养方法。细胞循环法一般包括静置、沉降以及膜过滤。细胞循环中膜过滤方法是在培养罐中添加一套合适的膜过滤装备，在培养过程中使用泵抽出发酵液，再截留细胞的同时加入新鲜培养液，控制管内培养液的体积不变。膜过滤方法需要特殊的生物反应器，所用的膜有纤维膜、陶瓷膜等。该方法也有他的缺陷，使用膜过滤方法可以达到很高的细胞浓度，但是滤膜容易被污染从而导致整个发酵罐中的培养液报废，且滤膜需要特殊设计，不能连续操作使用及大规模化生产，且膜过滤系统造价过高，成本高。

       混菌发酵：混菌发酵是指将一株或几株有利于或促进乳酸菌菌体生长繁殖的菌株接种到同一培养基中培养。在实际生产发酵过程中，关于乳酸菌和酵母菌共同发酵的例子很多。乳酸菌和酵母菌之所以可以共同生长繁殖，主要是因为一方面乳酸菌缺少很多营养物质的合成途径，而酵母菌正好可以为乳酸菌供应这些生长繁殖所需物质，例如维生素、氨基酸等营养物质，另一方面乳酸菌的代谢产物也可以被酵母菌利用。

       缓冲盐法：与化学中和法类似，也是为了维持乳酸菌生长繁殖所需的较合适的 pH 值范围，也是调节发酵液 pH 值的重要手段之一。缓冲盐可以使发酵液中的 pH 值在一定区间内保持相对稳定，减缓乳酸对乳酸菌的抑制作用。较为常见的缓冲盐有碳酸钙、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐等，国际上也有学者采用磷酸盐作为缓冲盐体系。和化学中和法一样，对于解除乳酸对乳酸菌的抑制作用是有限的。

       透析培养：透析培养法指在发酵液中加入合适孔径的半透明，以此节流微生物细胞、蛋白质等大分子或小分子物质，如乳酸等代谢产物可以通过透析膜渗透出去，从而降低发酵液中乳酸的含量，进一步解除乳酸对乳酸菌生长繁殖的抑制了。但透析培养的方法也存在弊端，就是投资大，易感染噬菌体、处理量大等不好的确定。

       化学中和法：在乳酸菌的高密度发酵过程中，经常使用中和剂来维持发酵液的 pH 值，使其在一个利于乳酸菌菌体生长繁殖的范围内，较常用的中和剂有氢氧化钾、氢氧化钠、氨水和碳酸钠等碱性物质。虽然加入中和剂后会维持pH值稳定在一个范围内，缓解乳酸对乳酸菌的抑制作用，之所以会缓解是因为乳酸变成了乳酸盐。但乳酸盐中的乳酸根离子仍然会抑制乳酸菌菌体法生长繁殖，因此化学中和法对于解除乳酸对乳酸菌的抑制作用是有限的。

       固定化：固定化发酵微生物的方法，其原理是使用物理或化学方法将获得微生物固定在一些合适的载体上，进而浓缩微生物菌体的一种技术手段。对于乳酸菌高密度发酵而言，主要使用的固定化方法是采用包埋法和吸附法。包埋法是将活的微生物菌体包裹在微小的孔隙中，这种方法可以防止细胞掉落，同时让培养液渗透到孔隙中供微生物菌体使用。吸附法是将载体经过一系列预处理后，通过物理吸附、离子结合等手段，使微生物活细胞结合在不溶于水的载体上。固定化方 法虽然在一定区域内可以取得较高的密度，但更多时候是应用在废水、废气处理方面。

       高密度发酵的应用

       在生物制品中的应用：试验研究表明，高密度发酵技术在利用工程菌生产各种干扰素、生长因子、生物酶、肽类、多糖等活性成分过程中得到了广泛应用。

       在食品工业中的应用：高细胞密度发酵技术可用于活细胞(即为所需产物)的培养，如通过改善培养环境和调控方式得到乳酸菌的高密度发酵，应用于乳制品行业。另外，高细胞密度发酵还可用于酵母菌生产酒精和利用螺旋藻细胞生产螺旋藻等。

       关键词：高密度发酵、发酵工艺、益生菌

       作者简介

       Martin Yu，食品科技工作者、营养师，长期负责特殊食品研发工作，主要方向为：FSMP、益生菌、特膳食品。