乳糖发酵与ONPG试验的讲解

       为庆祝第九届微生物检测与控制技术交流会召开，特此为大家讲授乳糖发酵与ONPG试验。

       各位亲，那乳糖发酵试验与ONPG试验，你有木有傻傻地分不清？还是听额细细道来哈。

       先说乳糖发酵试验，这是用来检测细菌分解乳糖能力的一种生化试验。大家知道，乳糖是葡萄糖和半乳糖这两个单糖，通过糖苷键连接而成一种双糖。而乳糖的分解呢，是乳糖在β-半乳糖苷酶的作用下，糖苷键发生断裂并产生葡萄糖和半乳糖。

       这β-半乳糖苷酶是在细胞内的咧，其实细菌分解乳糖，一般还需要一种位于细胞膜上的β-半乳糖苷渗透酶来参与。这β-半乳糖苷渗透酶的作用嘛，是将细胞外的乳糖分子主动转运到细胞内。所以说啊，乳糖发酵试验可以检测两种酶：β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷渗透酶。

       具有这两种酶的细菌，可迅速将乳糖分子主动转运到细跑内，在24小时内即可分解乳糖并产酸，导致乳糖发酵培养基的颜色发生变化，表现为乳糖发酵试验阳性。而缺乏此两种酶的细菌，因为不能分解乳糖产酸，乳糖发酵培养基不会变色，乳糖发酵试验呈现为阴性。还有一些乳糖迟缓发酵的细菌，只具备β-半乳糖苷酶，但是由于缺乏β-半乳糖苷渗透酶，乳糖只能通过被动扩散缓慢地进入细胞内，培养3天以上，才能使乳糖发酵培养基变色，表现为乳糖迟缓发酵。

       至于ONPG试验咧，是用于快速检测β-半乳糖苷酶的一种生化试验。与乳糖不同，邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）可迅速进入细菌细胞内，ONPG被β-半乳糖苷酶水解后，释放出黄色的邻硝基酚（ONP），培养基因此变黄，ONPG试验表现为阳性。细菌若没有β-半乳糖苷酶，就不分解进入细胞的ONPG，不能释放出黄色的ONP，ONPG试验结果也就为阴性。

       总而言之，不同的细菌具有不同的酶，乳糖发酵与ONPG试验可有以下四种结果。

       甲、乳糖发酵试验阳性，ONPG试验阳性： 对于大多数大肠埃希氏菌，由于同时具有β-半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶，其表现为发酵乳糖，ONPG试验也为阳性。

       乙、乳糖发酵试验阴性，ONPG试验阴性： 对于普通变形杆菌，β-半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶都木有，其表现为不发酵乳糖，ONPG试验为阴性。

       丙、乳糖发酵迟缓阳性，ONPG试验阳性：对于亚利桑那菌，虽然具有β-半乳糖苷酶，但缺少β-半乳糖苷渗透酶，其表现为乳糖迟缓发酵，ONPG试验还是阳性滴。

       丁、乳糖发酵试验阳性，ONPG试验阴性：有些不动杆菌和假单胞菌，β-半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶也都是木有，虽然不能分解乳糖，但是却可将乳糖转化为乳糖酸，也能导致乳糖发酵培养基变色，表现为发酵乳糖的假象，由于缺乏β-半乳糖苷酶，其ONPG试验却是阴性滴。

       亲，这乳糖发酵试验与ONPG试验，你都能分清了吧 ？是不是美滴很，美滴很？不要着急，还有一个赠品呢：下面再说说ONPG试验的注意事项。

       1、良好的缓冲作用是ONPG试验的关键，所以说接种前将那ONPG溶液，在36℃水浴一段时间，以溶解在储存过程中产生的磷酸盐结晶。

       2、细菌的接种量要大些哈，这样既可加快反应速度，也有利于结果观察。

       3、ONPG试剂一般情况下是无色的，但有时其中的蛋白胨可致试剂呈轻微黄色，此时应加做阴性对照予以区分。

       4、需要提醒的是，ONPG试验不能用于产黄色素细菌的检测，如果怀疑培养基变黄是细菌产黄色素的缘故，要先离心再来进行结果判读。

       5、葡萄糖对β-半乳糖苷酶有抑制作用，在含乳糖的培养基上生长的细菌，其β-半乳糖苷酶活性也就更高。总之，用乳糖含量高的培养基，就对咧！

       主要参考文献：

       1、J F MacFadden. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria[M]. Third Edition. Williams & Wilkins, Baltimore, 2000.

       2、Lapage S P, Efstratiou A, Hill L R. The ortho-nitrophenol （ONPG） test and acid from lactose in Gram-negative genera[J]. Journal of Clinical Pathology, 1973, 26（11）：821-825.