功能性肽的分离与富集

       功能性肽是指具有某种特定生物活性、对机体有益的肽类化合物，通常由两个及两个以上的α-氨基酸组成，广泛存在于动物、植物以及微生物机体中，可通过蛋白质降解或人工合成得到。按照来源可分为内源性功能肽和外源性功能肽，其中源于人体自身的肽称为内源性功能肽，可参与机体代谢；而人体之外的、存在于动植物和微生物中的肽，以及经蛋白质降解、氨基酸合成得到的肽则称为外源性功能肽，具有多种有益健康的生理功能。根据生物活性可以将功能性肽分为抗氧化肽、抗菌肽、血管紧张素转化酶抑制肽、抗肿瘤肽、免疫活性肽等。功能性肽分子质量较小、细胞透过性好、易被人体消化吸收，且毒副作用低，从而受到食品、药品、医疗等领域的高度关注。

       外源性功能肽的分离纯化

       肽可用于功能性食品、药物（抗癌、抗炎等）和化妆品的开发等。通过蛋白质降解或氨基酸合成得到的外源性功能肽是由游离氨基酸、不同分子质量的氨基酸组成的肽段、大量无机盐以及未水解蛋白质等物质组成的混合物。为了获得具有特定分子质量和氨基酸组成且具有特定功能活性的肽段，必须对混合物进行分离纯化。现阶段常用的分离纯化方法有电泳技术、膜分离技术、色谱技术以及多种方法联用等。随着肽组学的研究深入，又出现了一些新型的分离方法及分离材料，例如介孔材料、探针等。

       01、膜分离技术

       膜分离不同于传统意义上的过滤，其可以在一定的分子质量范围内进行肽混合物的精准分离，是单纯的物理作用，具有操作简单、不影响样品活性、适用性强等特点。根据膜的孔径大小可以分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜等。目前，超滤技术已经普遍用于酶解产物的分级分离中。膜分离技术通常作为肽分离纯化的第一步，不需化学反应，在常温条件下进行，过程简单，适宜大量混合物的分离。但是一定分子质量范围内存在着大量结构相似、质量相近的肽段；除此之外，肽的分离纯化容易受到脱盐的影响，膜材料也容易堵塞和污染，不利于资源的回收与利用。因此，对于肽的分离纯化，膜分离技术的选择性并不高。

       02、电泳技术

       用于肽分离的毛细管电泳有毛细管区带电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、亲和毛细管电泳、毛细管免疫电泳、芯片式毛细管电泳、阵列毛细管电泳等。电泳技术具有分辨率高、分离速度快的特点，但是进样量少、光路短，限制了其在肽分离纯化中的大规模制备及应用。

       03、色谱技术

       色谱技术是最为普遍的肽分离纯化方法。常用的色谱技术有大孔树脂吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、反相高效液相色谱法等。

       大孔树脂可将吸附和筛选相结合，利用各组分吸附力和分子质量大小不同进行分离。大孔树脂具有回收率高、选择性好、分离效率高、吸附条件温和等特点，广泛用于色素、多酚、生物活性肽等水溶性化合物的分离提纯。

       凝胶过滤层析能够分离酶解产物中的活性物质，但对于分子尺寸相近的肽，无法进一步纯化。凝胶过滤的分离效果易受到基质颗粒的大小及均匀程度的影响，常与其他分离方法（例如超滤等）联用才能达到最终分离纯化的目的。

       采用一种方式对蛋白质、肽等物质进行分离纯化，很难达生物分析的标准。多种方式联用可以实现肽混合物的精准分级分离，以获得高纯度的肽组分。如超滤-凝胶过滤色谱-高效液相色谱联用，离子交换色谱-凝胶过滤色谱-高效液相色谱联用。

       内源性功能肽的富集

       通常含有内源性功能肽的生物样品中成分浓度极低（小于1 nmol/L），而且蛋白质和内源性功能肽的物理化学性质极其相似。因此，内源性功能肽在富集过程中容易受到高含量蛋白及其他复杂成分的影响，选择性高效富集低浓度内源性功能肽成为生物分析的难点问题。按照肽的种类，富集方法可以分为糖肽的富集、磷酸肽的富集以及其他小分子肽的富集。

       01、糖肽的富集

       糖基化是重要的蛋白质翻译后的修饰之一，人体内约有一半以上的蛋白质会发生糖基化。糖肽的富集方法主要有凝集素亲和法、肼化学法、硼酸化学法、亲水作用法等。

       凝集素是一种可与多糖结合的蛋白，是最早运用于糖肽富集的物质。常用的凝集素材料有选择性结合甘露糖的伴刀豆凝集素A、结合N-乙酰神经氨酸单元的接骨木凝集素、与岩藻糖相结合的橙黄网胞盘菌凝集素、选择性识别N-乙酰葡糖胺的小麦胚芽凝集素等。凝集素亲和法的缺陷在于它只能与其识别的糖型结合，在选定凝集素的情况下，只有选择性吸附特定组成的部分糖肽。

       肼化学法富集糖肽的过程包括将糖链上的顺式邻二醇氧化成醛；醛基与固相支持物上的酰肼基团共价偶联。与凝集素亲和法不同，肼化学法可以吸附所有的糖蛋白。

       在碱性溶液中，糖链上的顺式邻位和硼酸基团发生反应形成环状二酯，从而进行糖肽的吸附；在酸性溶液中，发生碱性溶液中的可逆反应，即环状二酯水解，从而实现糖肽的解吸。

       02、磷酸肽的富集

       磷酸化肽的富集容易受到高浓度蛋白的影响，磷酸肽的富集方法主要有亲和色谱富集法、离子交换色谱法。磷酸肽的亲和色谱法富集主要分为金属氧化物亲和色谱法、固定化金属离子亲和色谱法和金属有机骨架法。离子交换色谱主要依据磷酸肽和非磷酸肽的电荷差异实现磷酸肽的富集，其中溶液的pH值是影响磷酸肽特异性吸附的重要因素。

       03、其他低浓度度肽的富集

       除了磷酸肽及糖肽，生物体内还有多种与生物体代谢及与生理活动密切相关的内源性功能肽。纳米材料与色谱法联用富集内源性功能肽，能够去除复杂成分和高浓度蛋白的影响，并且能定向提取某种肽类。其已经成功应用于人血清、小鼠大脑提取物及人体其他体液中内源性功能肽的富集，但是纳米材料不适用于大量的生物分析，且纳米材料也不易与样品分离，造成目标肽污染。因此，需要研制出更加快速、高效、易于分离的新型纳米材料。

       功能性肽可以用于功能性食品开发、疾病检测、美容用品研发等领域，具有极大的开发利用潜力，成为当前的热点。功能性肽的深入研究与人类健康息息相关，其分离与富集技术的优化能够促进食品、药品等行业的快速发展，为实现这个目标需要借助其他领域的新材料、新方法，发展出便捷、高效、覆盖面广的分离和富集方法，才能更便捷、更高效地得到功能性肽，为国民健康奠定坚实的基础。

       参考文献：

       [1]李欣蔚,廖佳,董秀瑜,周新,杨贺棋,武龙,汪秋宽,周慧.功能性肽的分离及富集研究进展[J].食品科学,2020,41(01):267-276.

       [2]CHALAMAIAH M, YU W L, WU J P. Immunomodulatory and anticancer protein hydrolysates (peptides) from food proteins: a review[J]. Food Chemistry, 2018, 245: 205-222.

       关键词：活性肽  分离纯化  富集

       作者简介：小泥沙，食品科技工作者，毕业于华南理工大学食品科学与工程学院，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。